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Ligature sans insert purifiant


Je prévois d'insérer une séquence de 45 pb dans un vecteur. Après avoir restreint mon insert pour créer des extrémités collantes compatibles, je ne trouve aucun moyen de le nettoyer. Existe-t-il un moyen de nettoyer ce fragment après restriction ou dois-je procéder sans nettoyage ?


Merci à tous pour vos commentaires les gars. J'ai essayé de purifier à l'aide d'un kit de purification PCR. J'ai pu récupérer 120 ng de fragment purifié à partir de 500 ng. C'est ok pour mon travail ultérieur.


Ligature de l'ADN¶

1 nmol d'ADN donneur peut être ligaturé à une quantité équivalente d'ADN accepteur dans ces conditions, en d'autres termes, utilisez de PETITES quantités de fragment et de vecteur (sinon il restera beaucoup de vecteur sans aucun fragment à la fin de la réaction)

Ce protocole suppose que tous les traitements nécessaires aux fragments d'ADN (par exemple : isolement des fragments d'ADN à partir d'agarose LM, remplissage/mastication des surplombs d'ADN, élimination de la phosphatase alcaline de PO4 des fragments d'ADN, addition de kinase de g-phosphates à 5'- OHs) ont déjà été effectuées et que les fragments sont prêts à être ligaturés les uns aux autres.

Après digestion de restriction et déphosphorylation (les deux étapes qui peuvent être effectuées dans la même réaction, l'une après l'autre, sans besoin de purification - isolement de fragment d'ADN à partir d'agarose LM-), le fragment déphosphorylé (généralement vecteur) peut être utilisé directement sans la nécessité d'une étape de purification (c'est particulièrement vrai si le vecteur n'a été linéarisé que par digestion avec une seule enzyme de restriction. Comme il n'y a qu'un seul fragment dans la réaction, il n'est pas nécessaire de le purifier sur gel. Pour ce faire, AP doit être inactivé par la CHALEUR (élimination de la phosphatase alcaline de PO4 des fragments d'ADN) avant la réaction de ligature


Astuce de clonage : ligature de plusieurs inserts

[2013.02.26 Edit : un certain nombre de personnes trouvent cela grâce à des recherches Google. Je n'ai pas d'article mis à jour sur le sujet, mais si vous essayez d'assembler plusieurs fragments d'ADN, je vous suggère de consulter Gibson Assembly. NEB vend * un mastermix ultra-simple, qui est un peu cher par réaction (je fais juste mes réactions la moitié de la taille) mais qui revient à bon marché lorsque vous tenez compte du coût de la main-d'œuvre (tant que votre PI valorise votre temps&# 8230).]

J'ai passé les deux derniers mois à construire une bibliothèque de plasmides et, ce faisant, j'ai pensé à une astuce. Les ligatures, peut-être la pire partie du clonage, sont des réactions notoirement capricieuses. Le but est de prendre plusieurs morceaux d'ADN linéaire, où les extrémités des morceaux ne peuvent se connecter que d'une certaine manière, puis d'utiliser une enzyme (T4 Ligase) pour les coudre tous ensemble en un seul morceau (dans mon cas, un plasmide circulaire ).

Figure 1. Ligase (2HVQ.pdb) rendue dans PyMOL. Cliquez pour voir un GIF animé de merde !

J'avais besoin d'insérer trois fragments à la fois dans une seule épine dorsale. Dans mon ignorance (à cause de mon manque d'expérience), je pensais que la ligature de quatre fragments devrait fonctionner aussi bien que deux, alors je les ai simplement tous réunis et j'ai exécuté la réaction. Le résultat était un gâchis, et quand j'ai testé 40 clones différents par la suite, aucun n'était correct. J'ai donc commencé à les ajouter une pièce à la fois, ce qui, évidemment, allait prendre trois fois plus de temps.

Le lendemain matin, sous la douche (l'un des meilleurs endroits pour des idées aléatoires), j'ai pensé que, bien que la plupart de ce qu'il y avait dans mon tube à essai était ne pas le produit souhaité, il y avait très probablement une petite population qui était le bon fragment. Le problème était simplement que mettre mes produits dans E. coli puis essayer de trouver la bonne chose ne fonctionnerait pas si seulement 1/100 (ou moins !) des produits de ligature étaient corrects. Mais la PCR est merveilleuse pour transformer de petites quantités d'ADN en grandes quantités, alors je me suis dit, pourquoi ne pas simplement essayer d'utiliser la PCR pour sortir la bonne chose du désordre ? Étant donné que chaque produit est constitué d'une combinaison des fragments d'entrée, les longueurs seraient discrètes et donc visibles et, potentiellement, séparables sur un gel. J'avais juste besoin d'être capable de copier suffisamment pour que je puisse voir L'ADN a été exécuté sur un gel, puis j'ai pu purifier celui qui était de la bonne longueur.

Figure 2. Chaque fragment de couleur différente est ligaturé dans le squelette gris. Les amorces (flèches noires) flanquent l'ensemble de l'insert.

J'ai conçu des amorces qui flanqueraient l'insert combiné et faisais de la PCR, et j'ai effectivement obtenu une bande de la longueur souhaitée ! Après purification sur gel, j'ai pu ligaturer l'ensemble de l'insert dans le squelette sans aucun problème.

Vous vous demandez peut-être : « N'est-ce pas maintenant un processus en deux étapes, juste une de moins que les trois nécessaires autrement, et cela en vaut à peine la peine ? » Presque, sauf qu'il n'est pas nécessaire de transformer le multi -mélange de ligature de fragments. Donc, cela ressemble plus à 1,5 pas. De plus, la ligature, la PCR, la purification sur gel, la ligature finale et la transformation finale peuvent toutes être effectuées en une seule journée !

Bien que mes collègues de laboratoire aient été surpris lorsque cela a fonctionné, il s'est avéré que j'étais un an trop tard pour publier cette idée :(. Si vous avez accès à Biochimie analytique, voir l'article d'An, Wu et Lv intitulé « Méthode de PCR après ligature pour le clonage de plusieurs inserts d'ADN ». Si vous n'avez pas cette chance, je vous ai déjà dit tout ce que vous devez savoir !


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ADN ligase T4

L'ADN ligase du bactériophage T4 est un polypeptide unique avec un M.W de 68 000 Daltons nécessitant de l'ATP comme source d'énergie. La plage de pH d'activité maximale est de 7,5 à 8,0. L'enzyme présente 40 % de son activité à pH 6,9 et 65 % à pH 8,3. La présence d'ion Mg++ est requise et la concentration optimale est de 10 mM.

L'ADN ligase T4 a la capacité unique de joindre des fragments collants et à extrémités franches. La ligature cohésive des extrémités est réalisée entre 12°C et 16°C pour maintenir un bon équilibre entre l'annelage des extrémités et l'activité de l'enzyme. Si la réaction est réglée à des températures plus élevées, le recuit des extrémités devient difficile, tandis que des températures plus basses diminuent l'activité de la ligase. Toute l'ADN ligase T4 est inactivée par chauffage à 65°C pendant 10 minutes. En plus de ces extrémités cohésives complémentaires de ligature, la ligase T4 peut ligaturer n'importe quelles deux extrémités franches d'ADN. L'absence de terminaisons cohésives rend la ligature des extrémités émoussée plus complexe et nettement plus lente. Étant donné que le recuit des extrémités n'est pas un facteur, la réaction est effectuée à 24 °C. Cependant, 10 à 100 fois plus d'enzymes sont nécessaires pour obtenir une efficacité de ligature similaire à celle de la ligature d'extrémité cohésive. L'enzyme est impliquée dans la catalyse de la jonction de l'ARN à un brin d'ARN ou d'ADN dans une molécule duplex, mais cela ne sera pas impliqué dans la jonction d'acides nucléiques simple brin.


Produits connexes

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Abréviations

ADNc, ADN complémentaire CDS, séquence codante GO, ontologie génique GSEA, analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes HA, hémagglutinine IP, immunoprécipitation mTOR, cible mammifère de la rapamycine NES, score d'enrichissement normalisé OPC, cellule précurseur d'oligodendrocytes ORF, cadre de lecture ouvert PBS, tampon phosphate PCR saline, amplification en chaîne par polymérase qPCR, PCR quantitative RT, transcription inverse TE, efficacité de traduction TOP, oligopyrimidine terminal uORF, cadre de lecture ouvert en amont UTR, région non traduite


Pourquoi voudrais-je utiliser le clonage Blunt-End ?

Imaginez que vous souhaitiez cloner un produit PCR qui contient de nombreux sites d'endonucléases de restriction à extrémité cohésive communs, tels que EcoRI ou HindIII, aux extrémités et à l'intérieur de la séquence. Il serait difficile d'effectuer des digestions partielles qui génèrent les surplombs collants sans également découper votre produit PCR (voir Fig 1.). (REMARQUE : cela n'est vrai que si vous utilisez une ADN polymérase qui a une fonction de relecture telle que Pfu. Plus d'informations à ce sujet ci-dessous dans la discussion sur le fonctionnement du clonage d'extrémités franches).

Figure 1 : La présence de sites de restriction dans l'insert rend difficile la digestion et le clonage dans le MCS du vecteur.

Considérez un autre scénario, vous souhaitez cloner des fragments d'ADN génomique après avoir physiquement cisaillé et réparé les extrémités. Vous pouvez vous attendre à ce que ces extrémités soient aléatoires dans la séquence de nucléotides et varient en nombre de nucléotides à chaque extrémité et d'un fragment à l'autre. Il serait difficile, voire impossible, de les cloner dans le site de multiclonage de n'importe quel vecteur (voir figure 2). Cependant, après la réparation des extrémités, toutes les extrémités seraient émoussées et compatibles avec un vecteur linéarisé à extrémités émoussées.

Figure 2 : Les fragments DAN cisaillés de manière aléatoire sont tous compatibles avec les ligatures à extrémités franches

Quoi qu'il en soit, le principal avantage du clonage à extrémités franches est l'universalité des extrémités franches, alors que le clonage de fragments à extrémités collantes doit tenir compte de la complémentarité des séquences surplombantes.


Soyez prudent dans la conception d'amorces plasmidiques pour le clonage de gènes

Sur la base de l'image ci-dessus, vous pouvez dire que si un site de restriction d'enzyme se trouve à l'intérieur de votre gène d'intérêt, vous ne pouvez pas utiliser cette enzyme de restriction car vous couperez votre gène. De plus, vous mettrez ce gène dans un nouveau plasmide. Assurez-vous que l'enzyme de restriction que vous utilisez est compatible avec le “site de clonage multiple” dans ce nouveau plasmide. Si vous finissez par insérer ce gène à des emplacements aléatoires, la probabilité que ce plasmide soit incorporé dans la bactérie ou étendu sera considérablement réduite.

Regardez l'image ci-dessous pour comprendre ces conseils :


Clonage sans restriction-ligation (RLF) : une méthode de clonage à haut débit par recombinaison homologue in vivo de produits de PCR

Dans cette étude, nous avons optimisé une méthode sans restriction-ligation (RLF) pour économiser du temps et des coûts de construction de plusieurs plasmides avec le même insert de gène, et avons examiné l'efficacité de RLF sur le clonage multi-plasmide à haut débit. Cette méthode utilise les systèmes précis de réparation et de recombinaison de l'ADN au sein d'Escherichia coli, ce qui permet de contourner les réactions enzymatiques de restriction et de ligature in vitro couramment incluses dans les procédures de clonage de routine. Un bras homologue est lié à l'extrémité 5' de l'amorce directe utilisée pour amplifier à la fois le gène cible et le vecteur. Un bras homologue différent est lié à l'extrémité 5' de l'amorce inverse. Par conséquent, les gènes peuvent être clonés dans les vecteurs par recombinaison homologue après co-transformation du gène cible amplifié et du vecteur linéarisé, qui portent le même bras homologue à chaque extrémité. Plus de vingt-quatre plasmides différents ont été générés par cette méthode, qui utilise deux étapes simples de réaction en chaîne par polymérase. Cette méthode est très efficace pour cloner n'importe quel gène d'intérêt dans n'importe quel vecteur sur n'importe quel site sans contraintes de séquence, car aucune réaction de restriction et de ligature n'est requise.


Conseils de clonage de restriction

Pour de nombreuses applications, le clonage de restriction conventionnel reste la meilleure méthode. Quelques astuces simples vous aideront à assurer le bon déroulement de votre clonage.

  1. Tout d'abord, soyez prudent à chaque étape d'une procédure. Cette approche permet de gagner du temps à long terme.
  2. Assurez-vous que l'ADN est très propre. Commencez avec environ 2 g d'ADN lors de la préparation d'un vecteur ou de l'excision d'un fragment à insérer.
  3. Après chaque réaction enzymatique, purifier l'ADN avec une colonne tournante. Éluer l'ADN dans 40 à 45 ul de Tris 10 mM (pH 8,5), puis effectuer la réaction suivante. (Il n'est pas nécessaire d'utiliser une colonne tournante avant de purifier un fragment d'ADN avec un gel.)
  4. Pour maximiser l'efficacité, minimisez le nombre d'étapes d'une procédure. Par exemple, il est préférable de cloner un fragment à extrémités franches dans un site vecteur franc, tel qu'un site SmaI, que dans un site qui a été rendu franc avec Klenow ou T4 ADN polymérase.
  5. En cas de doute, purifiez un fragment d'ADN avec un gel. Un matériau de départ plus propre donnera un meilleur résultat.

Le problème le plus courant avec le clonage de restriction est que le vecteur de départ est récupéré après la procédure. Ce problème a deux causes : une digestion incomplète du vecteur et une religature du vecteur coupé avec lui-même. Les astuces décrites ci-dessous minimiseront ces effets.

    Assurez-vous que la digestion du vecteur est terminée. Utiliser un excès d'enzyme de restriction (

20 U pour 2 g d'ADN), et digérer pour

Avec le vecteur, assurez-vous que les réactions de digestion et de phosphatase se terminent. Vortexer les mélanges soigneusement et à plusieurs reprises, et ne laisser aucune goutte de liquide s'échapper du traitement enzymatique. C'est une bonne idée de faire tourner brièvement après le vortex pour s'assurer qu'il ne reste aucune gouttelette sur le côté du tube.

Préparation du fragment inséré

  1. Pour la préparation d'un fragment inséré, une digestion incomplète n'est pas un problème sérieux car une récupération partielle du fragment est acceptable. Vous pouvez utiliser des temps de digestion relativement courts et pour une double digestion, vous pouvez utiliser un tampon de réaction sous-optimal pour une ou les deux enzymes.
  2. Purifier le fragment inséré avec un gel. En plus d'éliminer l'ADN indésirable ou incomplètement digéré, cette procédure élimine les enzymes et les petites molécules. Lors de la visualisation de bandes d'ADN avec un transilluminateur, n'utilisez pas de lumière UV à courte longueur d'onde de 312 nm ou moins car l'ADN sera gravement endommagé. Utilisez plutôt une lumière UV 360-365 nm.
  3. Si le fragment inséré a été généré par PCR, purifiez-le avec un gel ou une colonne de centrifugation avant de faire des digestions de restriction. Si vous envisagez de cloner un fragment PCR à extrémités franches (généré avec une polymérase telle que Pfu) dans un vecteur traité à la phosphatase, assurez-vous que vos amorces PCR contiennent des 5′-phosphates.

Ligature et transformation

  1. Avec un vecteur traité à la phosphatase, effectuez une ligature de contrôle dans laquelle le fragment inséré est omis. Cette ligature de contrôle devrait donner très peu de transformants car seules les molécules d'ADN circulaires transforment E. coli efficacement, et la recircularisation du vecteur ne peut pas se produire sans ligature à un fragment phosphorylé.
  2. Si l'ADN n'a que des extrémités collantes, ligaturez à température ambiante pendant


Voir la vidéo: TYPEFACE with OpenType Feature. Decorative ligatures. Hand Stamp Swiss Rough Sans. myfonts (Janvier 2022).